DPPH 분석의 원리와 단점, 항산화력 시험

1. DPPH 란?

DPPH은 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl의 약자로, 자유 라디칼을 가지고 있는 물질입니다. DPPH는 자유 라디칼을 가지고 있기 때문에 항산화 분석에 많이 사용됩니다.

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DPPH는 UV-vis 분광광도계 (Spectrophotometry) 를 사용하였을 때 520nm에서 Peak을 가지고 있으며 보라색을 띄고 있습니다. 그러나 DPPH의 자유 라디칼이 소거되었을 경우 노란색으로 변화하여 눈으로 확인할 수 있으며 520nm에서 Peak은 감소합니다. 즉, 높은 항산화 능력을 가진 샘플을 사용할 경우 노란색으로 변하며 520nm에서 Peak은 감소합니다.

2. DPPH 분석

DPPH의 이러한 특성을 이용하여 항산화 능력을 측정하는 분석에 사용되는데, DPPH 분석은 1958년 스탠포드 대학의 Marsden Blois가 소개한 방법입니다.
Blois, Marsden S. "Antioxidant determinations by the use of a stable free radical." nature 181.4617 (1958): 1199-1200.

 

앞서 서술하였듯이, DPPH 분석은 UV-vis 분광광도계나 EPR (Electron paramagnetic resonance)를 이용하여 측정이 가능하며 분광광도계의 경우 520nm에서 흡광도를 비교하여 항산화 능력을 측정할 수 있습니다.

 

DPPH 분석을 할 때 많이 사용하는 파라미터는 Efficient concentration (EC) 이며 Brand-Williams 등이 소개하였습니다.
Brand-Williams, Wendy, Marie-Elisabeth Cuvelier, and C. L. W. T. Berset. "Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity." LWT-Food science and Technology 28.1 (1995): 25-30.

DPPH가 샘플과 반응하고 남아있는 양이 50% 일 때의 농도를 EC50 이라고 하며 EC50 의 Steady-state 에 도달하는 시간은 샘플의 물질, 농도에 따라 다를 수 있으며 Kinetic curve를 측정하여 구할 수 있습니다.

3. DPPH 분석의 원리

자유 라디칼이 존재하는 항산화 반응의 매커니즘은 수소원자전달 (Hydrogen atom transfer, HAT), 단일전자전달 (Single electron transfer, SET) 매커니즘 등이 있습니다.

수소원자전달 매커니즘은 수소와 전자가 단일단계로 이동하는 것을 말하며 이때 자유라디칼은 항산화제의 수소원자에 의해 제거되며 수소원자와 항산화제의 결합력 (Bond dissociation enthalpy, BDE)는 항산화력을 측정하는데 중요한 파라미터 입니다. 이 결합력이 작을수록 수소원자는 더 쉽게 자유 라디칼과 결합을 할 수 있습니다.

 

단일전자전달 매커니즘은 전자가 항산화제에서 이동하는 것을 의미하며 항산화제는 자유라디칼에 전자를 제공하게 됩니다. 항산화제의 전자의 이온화 에너지 (Ionization potential, IP)는 항산화력을 측정하는데 중요한 파라미터 입니다. 이 이온화 에너지가 낮을수록 전자는 쉽게 전달이 될 수 있습니다.

 

HAT과 SET 반응을 동시에 연속적으로 발생하며 구별하는 것은 쉽지 않습니다. DPPH 분석의 경우 HAT와 SET 그리고 혼합 매커니즘이 존재한다고 알려져 있습니다.

4. DPPH 분석의 단점

DPPH 분석은 상대적으로 간단한 실험에 속하지만 단점 역시 존재합니다.

 

DPPH의 자유 라디칼을 형성하고 있는 부분은 DPPH의 가운데에 위치하고 있는 질소 (N) 원자입니다. 퍼옥시 라디칼과 빠르게 반응하는 다른 항산화제와는 달리 DPPH에 느리게 반응하거나 반응하지 않을 수 있습니다. 실험에 사용하고자 하는 샘플의 분자가 작을 경우 DPPH에 충분히 접근할 수 있으나 큰 분자인 경우 DPPH의 자유 라디칼에 접근하기 어려울 수도 있습니다.

 

또한 DPPH는 Eugenol과 가역적으로 반응한다고 알려져 있으며 이는 Eugenol을 포함하거나 이와 비슷한 페놀을 가진 유사한 구조을 가지고 있을 경우 샘플의 항산화 능력이 잘못 측정될 수 있습니다.

 

DPPH는 물에 녹지 않으므로 알코올계 용매가 필요하며 단백질은 에탄올에 의하여 침전 (Precipitation)이 될 수 있으므로 주의하여야 합니다.