280nm에서 단백질 흡광계수 이론적으로 계산하기 (Extinction coefficient)

1. 서론

생물공학 실험에서 분광기(Spectrophotoscopy)를 이용하여 흡광계수(Extinction coefficient)를 정확히 측정하는 것은 중요합니다.

 

비어 람버트 식(Beer Lambert equation)을 통해 흡광도(A), 흡광계수(ε), 농도(C), 셀 길이(L)를 구할 수 있습니다.

 

비어 람버트 식: A = εCL

 

일반적으로, 분광기(Spectrophotoscopy)를 사용하여 흡광도(A)를 측정하고, 측정했던 농도(C)를 알고 있기 때문에

 

Standard curve를 그리고, 기울기를 측정하여 해당 단백질의 흡광계수(ε)를 측정할 수 있습니다.

 

 

특히, 단백질의 경우 트립토판(Trp), 타이로신(Tyr), 시스테인(Cys) 등 아미노산이 280nm에서 흡광도를 나타내는데 중요한 역할을 합니다.

 

2. 흡광계수 이론적 예측의 필요성

해당 시료가 없어 당장 실험을 진행할 수 없거나, 시료가 너무 적어 실험을 진행하기 어려울 경우

 

280nm에서 단백질의 흡광계수(ε)를 이론적으로 계산하고 우리가 원하는 영역의 흡광도(A)를 나타낼 수 있습니다.

 

비어 람버트 식: A = εCL

 

예를 들어, 해당 시료의 흡광도(A)를 1로 나타내고 싶다면,

 

비어 람버트 식: 1 = εCL

 

C = 1 / εL

 

로 흡광계수(ε)만 알 수 있다면 실험에 필요한 농도를 특정할 수 있습니다.

(물론, 가장 빠른 방법은 280nm에서 흡광계수(ε)의 Reference를 찾는 것입니다.)

 

3. 흡광계수 이론적 예측

https://www.rcsb.org/

RCSB PDB: Homepage

 

PDB bank에서 흡광계수 예측을 위한 단백질 코드(Sequence)를 불러옵니다.

 

예를 들어, T4 Lysozyme(라이소자임) 6LZM.pdb의 아미노산 코드입니다.

 

SEQRES   1 A  164  MET ASN ILE PHE GLU MET LEU ARG ILE ASP GLU GLY LEU          
SEQRES   2 A  164  ARG LEU LYS ILE TYR LYS ASP THR GLU GLY TYR TYR THR          
SEQRES   3 A  164  ILE GLY ILE GLY HIS LEU LEU THR LYS SER PRO SER LEU          
SEQRES   4 A  164  ASN ALA ALA LYS SER GLU LEU ASP LYS ALA ILE GLY ARG          
SEQRES   5 A  164  ASN CYS ASN GLY VAL ILE THR LYS ASP GLU ALA GLU LYS          
SEQRES   6 A  164  LEU PHE ASN GLN ASP VAL ASP ALA ALA VAL ARG GLY ILE          
SEQRES   7 A  164  LEU ARG ASN ALA LYS LEU LYS PRO VAL TYR ASP SER LEU          
SEQRES   8 A  164  ASP ALA VAL ARG ARG CYS ALA LEU ILE ASN MET VAL PHE          
SEQRES   9 A  164  GLN MET GLY GLU THR GLY VAL ALA GLY PHE THR ASN SER          
SEQRES  10 A  164  LEU ARG MET LEU GLN GLN LYS ARG TRP ASP GLU ALA ALA          
SEQRES  11 A  164  VAL ASN LEU ALA LYS SER ARG TRP TYR ASN GLN THR PRO          
SEQRES  12 A  164  ASN ARG ALA LYS ARG VAL ILE THR THR PHE ARG THR GLY          
SEQRES  13 A  164  THR TRP ASP ALA TYR LYS ASN LEU  

 

 

280nm에서 흡광도를 나타내는 트립토판(Trp), 타이로신(Tyr), 시스테인(Cys)의 개수를 세어줍니다.

 

T4 Lysozyme(라이소자임) 6LZM.pdb의 경우 

트립토판(Trp): 3개

타이로신(Tyr): 5개

시스테인(Cys): 2개

 

---

흡광계수(ε) (280nm) = 트립토판(Trp) * 5500 + 타이로신(Tyr) * 1490 + 시스테인(Cys) * 125

---

 

T4 Lysozyme(라이소자임) 6LZM.pdb의 경우 

흡광계수(ε) (280nm) = 3 * 5500 + 5 * 1490 + 2 * 125 = 24200

 

T4 Lysozyme(라이소자임) 6LZM.pdb의 흡광계수(ε)는 24200M-1cm-1로 예측되었습니다.

 

 

3. 흡광계수 이론적 예측과 실험적 실제 값 비교

실제로, T4 Lysozyme(라이소자임)의 흡광계수(ε)는 24227M-1cm-1로

 

T4 Lysozyme(라이소자임) 6LZM.pdb의 흡광계수(ε) 예측값인 24200M-1cm-1과 비슷하게 예측되었습니다.

 

 

따라서, 

 

비어 람버트 식: A = εCL

 

비어 람버트 식에 적용하여 흡광도 1로 측정되도록 하고 싶다면

 

비어 람버트 식: 1 = εCL

비어 람버트 식: C = 1 / εL = 1 / 24200

C = 0.041 mM

 

결국, 0.041mM의 농도로 T4 Lysozyme(라이소자임)을 분광기(Spectrophotoscopy)로 측정하면

흡광도 1에 가까운 값을 구할 수 있습니다.

 

 

4. 참고자료

Gill, Stanley C., and Peter H. Von Hippel. "Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data." Analytical biochemistry 182.2 (1989): 319-326.

 

Pace, C. Nick, et al. "How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein." Protein science 4.11 (1995): 2411-2423.

 

Anders, John C., et al. "Using amino acid analysis to determine absorptivity constants: A validation case study using bovine serum albumin." Biopharm international 16 (2003): 30-43.